Metoda uključuje drobljenje i homogenizaciju proklijalog korijena rena, ekstrakciju homogeniziranog korijena rena sa 0,15±0,01 M rastvorom natrijum hlorida. Balastni proteini se odvajaju i peroksidaza se precipitira sa solima amonijum sulfata 45-48% zasićenosti i 85-90% zasićenosti, respektivno. Gel filtracija rastvora peroksidaze se vrši na Sephadexu G-100 uz eluiranje sa 0,15-0,2 M rastvorom natrijum hlorida. Kromatografsko prečišćavanje se vrši na karboksimetilcelulozi. Ciljana peroksidaza se suši zamrzavanjem. Dijaliza se provodi protiv natrijum acetatnog pufera sa pH 4,4-5,0 i dijaliza protiv kalijum fosfatnog pufera sa pH od 8,0±0,1. Koncentriranje se vrši uz dodatno prečišćavanje na DEAE-celulozi uz eluiranje istim puferom, nakon čega slijedi dijaliza protiv deionizirane vode. Metoda omogućava dobivanje peroksidaze visoke specifične aktivnosti i visokog prinosa. Prinos peroksidaze je 2,52-3,50 g/kg korijena rena, specifična aktivnost je 640-700 E.A./mg proteina. 5 plata f-ly, 2 ill., 1 stol.

Crteži za RF patent 2353652

Pronalazak se odnosi na oblast biotehnologije, odnosno na proizvodnju enzima iz biljnog materijala, a može se koristiti za laboratorijsku i industrijsku proizvodnju enzima peroksidaze iz korijena rena za imunologiju i imunohemiju kao glavne komponente konjugata za enzimske imunotestove.

Poznate su različite metode za dobivanje peroksidaze iz korijena hrena.

Poznata je metoda za proizvodnju peroksidaze iz korijena hrena, uključujući homogenizaciju korijena rena, ekstrakciju enzima fiziološki rastvor, precipitacija enzima sa solima amonijum sulfata, gel filtracija, taloženje alkohola, elektroforeza, reprecipitacija amonijum hloridom, filtracija kroz Sephadex G-50 i DEAE-celulozu i dijaliza.

Glavni nedostaci ove metode su niska aktivnost i čistoća dobivenog proizvoda, kao i složenost njegove pripreme i veliki broj faza tehnološkog procesa.

Poznata je i metoda za proizvodnju peroksidaze iz korijena hrena, u kojoj se korijeni rena homogeniziraju, zatim se enzim ekstrahuje vodom i peroksidaza istaloži solima amonijum sulfata, nakon čega slijedi gel filtracija [Pat. Mađarska 172872, C07G 7/022].

Nedostatak ove metode je nizak prinos i niska čistoća enzima.

Poznata je metoda [A.S. Bugarska 46675, C12N 9/08, 15/02/90], prema kojem se koren rena klija 2-3 dana, zatim homogenizuje i enzim ekstrahuje vodom 24 sata. Vodeni ekstrakt se centrifugira, nakon čega slijedi frakcioniranje proteina sa solima amonijum sulfata, zatim se amonijum sulfatni talog enzima otopi u destilovanoj vodi i podvrgne ultrafiltraciji na filterima Milipor PTGC 000 05. Doda se 0,5 M fosfatni pufer (pH 8). na dobijeni filtrat u omjeru 100 dijelova pufera na 1 dio filtrata i propušten kroz kolonu sa DEAE-Sephadex A-50 ionskim izmjenjivačem, zatim uzastopno ultrafiltriran na Milipor PTGC 000 05, RTNK 000 05, PTGC 000 0 i podvrgnuti sušenju zamrzavanjem.

Nedostatak ove metode je nedovoljno visok prinos peroksidaze, veliki radni intenzitet i trajanje procesa.

Najbliža je metoda [Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 05/10/1999], u kojem se vodom oprano korijenje rena oguli do 1/3 mase u prisustvu 0,25% otopine askorbinske kiseline prehrambene kvalitete, koja se koristi kao otopina za ekstrakciju . Peroksidaza iz prečišćavanja se ekstrahuje 1 sat sa 0,25% rastvorom askorbinske kiseline, zatim se ekstrakt filtrira i centrifugira. Dodati 5% natrijum sulfita u supernatant i inkubirati 24 sata sobnoj temperaturi za "sazrevanje" enzima. “Sazrela” otopina enzima koncentrira se na ultrafiltracionom aparatu za vlakna sa filterima prečnika pora manjim od 40 kDa. Amonijum sulfat se dodaje u koncentrovanu otopinu 10 puta do konačnog zasićenja od 85-90%, centrifugira, talog se otopi u desetostrukoj zapremini dvostruko destilovane vode i nanese na kolonu napunjenu Sephadexom G-25, eluira se ispraznite dvostruko destilovanom vodom. Sakupljaju se frakcije koje sadrže peroksidazu sa R ​​Z vrijednošću >0,1. Sakupljenim frakcijama se dodaje amonijum sulfat do zasićenja od 85-90%, centrifugira se, talog se rastvori u 3-strukoj zapremini bidestilisane vode i nanese na kolonu za gel filtraciju napunjenu Sephadexom G-50, eluiranje se vrši sa bidestilovana voda. Sakupljaju se frakcije koje sadrže peroksidazu sa RZ vrijednošću >0,5. Frakcije se pomešaju, titriraju do pH 4,4 i prečiste na karboksimetilcelulozi, enzim se eluira u gradijentu koncentracije od 5 mM do 0,15 M acetatnog pufera (pH 4,4) (V=S-500 ml, R-500 ml). Sakupljaju se frakcije sa R ​​Z vrijednošću >2,7 i koncentracijom enzima od najmanje 10 mg/ml. Frakcije se sjedine, titriraju do pH 5,0 i osuše smrzavanjem.

Nedostaci ove metode su nedovoljno visoka čistoća i aktivnost i mali prinosi peroksidaze.

Pronalazak rješava problem stvaranja industrijske metode za proizvodnju peroksidaze iz korijena hrena, koja omogućava dobivanje peroksidaze visoke čistoće, visoke specifične aktivnosti i visokog prinosa.

Problem je riješen metodom za dobivanje enzima peroksidaze iz korijena hrena, koja uključuje drobljenje i homogenizaciju proklijalog korijena hrena, ekstrakciju homogeniziranog korijena hrena, odvajanje balastnih proteina i taloženje peroksidaze solima amonijum sulfata, gel filtraciju peroksidaze. rastvor na Sephadexu, hromatografsko prečišćavanje na karboksimetilcelulozi, sušenje zamrzavanjem ciljne peroksidaze, dok se zdrobljeni koreni rena ekstrahuju sa 0,15±0,01 M rastvorom natrijum hlorida sa pH=4,4±0,2; gel filtracija rastvora peroksidaze se vrši na Sephadexu G-100 uz eluiranje sa 0,15-0,2 M rastvorom natrijum hlorida sa pH 4,4-5,0, dijaliza se izvodi protiv natrijum acetatnog pufera sa pH 4,4-5,0 i dijaliza protiv kalijum fosfatnog pufera sa pH 8,0±0,1 i koncentracija uz dodatno prečišćavanje na DEAE celulozi uz eluiranje istim puferom, nakon čega slijedi dijaliza protiv deionizirane vode.

Precipitacija proteina solima amonijum sulfata koristi se dva puta: 45-48% zasićenja koristi se za odvajanje balastnih proteina, a 85-90% zasićenja se koristi za taloženje peroksidaze,

Kromatografskom prečišćavanju peroksidaze na karboksimetilcelulozi prethodi dijaliza protiv natrijum acetatnog pufera sa pH 4,4-5,0.

Sušenju zamrzavanjem prethodi dijaliza otopine peroksidaze protiv deionizirane vode.

Slika 1 prikazuje šematski dijagram izolacije peroksidaze iz korijena hrena.

Koren hrena se opere tekuća voda i klija 140-160 sati na temperaturi od +25±1°C. Proklijalo korijenje se drobi i ekstrahuje sa 0,15 M rastvorom natrijum hlorida 12±2 sata uz stalno mešanje, a zatim centrifugira.

16,7±0,05 kg (45-48% zasićenja) amonijum sulfata se dodaje u supernatant-1 (slika 1) uz neprekidno mešanje, dobijeni talog se odvaja centrifugiranjem, a još 11 dodaje se u nastali supernatant-2 (slika 1. 0,8±0,05 kg (85% zasićenja) amonijum sulfata, talog (slika 1) se odvoji centrifugiranjem i rastvori sa destilovanom vodom do konačne zapremine od 200±10 ml. Nakon centrifugiranja, supernatant koji sadrži peroksidazu se nanosi na kolonu napunjenu Sephadexom G-100 i eluira sa 0,15 M rastvorom natrijum hlorida brzinom od 100 ml/h, tokom eluiranja sakupi se frakcije od 20 ml. U prikupljenim frakcijama se mjeri R Z =D 408 /D 275. Frakcije u kojima RZ nije manji od 0,8 se kombinuju i dijaliziraju protiv natrijum acetatnog pufera (pH 4,4 ± 0,2) (pufer-1), zatim se osoljeni rastvor peroksidaze nanese na kolonu ispunjenu karboksimetilcelulozom i uravnoteži puferom-1, i eluirati sa linearnim gradijentom od 5 mM - 0,1 M acetatnog pufera (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Vrijednost RZ se mjeri u proteinskim frakcijama. Frakcije u kojima je RZ vrijednost najmanje 2,5 se kombinuju i dijaliziraju protiv kalij-fosfatnog pufera (pH 8,0 ± 0,1) (pufer 2), dijalizirani rastvor enzima se nanese na kolonu ispunjenu DEAE celulozom i eluiranim puferom-2. Frakcije u kojima je RZ vrijednost najmanje 3,0 se kombinuju i dijaliziraju protiv deionizirane vode, zatim se prebace u sterilnu tikvicu otpornu na toplinu, zamrznu tečnim dušikom i osuše smrzavanjem dok se preparat potpuno ne osuši.

Bitne karakteristične karakteristike predložene metode za dobijanje biološki aktivnih supstanci su:

Korištenje gel filtracije na Sephadex G-100 za maksimum kompletno čišćenje peroksidaze iz nečistoća male molekularne težine;

Dijaliza protiv natrijum acetatnog pufera (pH 4,4-5,0), koja vam omogućava da odsolite otopinu peroksidaze i pripremite je za kromatografiju na karboksimetilcelulozi;

Dijaliza protiv pufera kalijum fosfata (pH 8,0±0,1), koji omogućava da se rastvor peroksidaze pretvori u optimalni pufer sa optimalnim pH za primenu na DEAE celulozu;

Ionska izmjenjivačka hromatografija peroksidaze na DEAE-celulozi kao tehnika koja obezbjeđuje ne samo dodatno pročišćavanje, već i koncentraciju rastvora enzima.

Stoga predlažemo novi pristup koji omogućava preradu korijena hrena kako bi se dobio enzim peroksidaze visoke čistoće i specifične aktivnosti.

Razlika između predložene metode i najbližeg analoga i prototipa je sljedeća.

U predloženoj metodi, zdrobljeni korijen hrena ekstrahuje se sa 0,15±0,01 M rastvorom natrijum hlorida sa pH=4,4±0,2, čime se postiže najpotpuniji prenos enzima u rastvor, a da pri tome enzim ne gubi svoju vrednost. aktivnost.

U analogu pronalaska [Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 05/10/1999] peroksidaza iz prečišćavanja (bez homogenizacije!) ekstrahuje se 1 sat sa 0,25% rastvorom prehrambene askorbinske kiseline, što može uticati na prinos peroksidaze, jer prečišćavanja nisu homogenizovana , te stoga enzim ne ide u potpunosti u otopinu, a ekstrakcija se događa u kiselim uvjetima, što može dovesti do djelomične inaktivacije enzima. U prototipu pronalaska [A.S. Bugarska 46675, C12N 9/08, 02/15/90] enzim iz homogenizata korena rena se ekstrahuje vodom, što takođe dovodi do niskog prinosa peroksidaze iz homogenizata u rastvor.

Za razliku od analoga pronalaska, gde se peroksidaza taloži dva puta sa 85-90% zasićenosti amonijum sulfatom, i prototipa pronalaska, gde se proteini precipitiraju sa solima amonijum sulfata četiri puta, u traženoj metodi, balastni proteini se odvajaju sa 45-48% zasićenja, a zatim se peroksidaza istaloži sa 85% zasićenja.

U analogu i prototipu pronalaska koncentracija se vrši ultrafiltracijom, dok u analogu izuma ultrafiltracija prethodi taloženju peroksidaze amonijum sulfatom, što dovodi do velike vjerovatnoće koprecipitacije nečistoća proteina, a samim tim i do niža čistoća konačnog proizvoda. U predloženoj metodi, peroksidaza se koncentriše na sorbent za jonsku izmjenu DEAE-celuloze u završnoj fazi tehnološkog procesa, što dovodi do dodatnog pročišćavanja enzima.

U predloženoj metodi, gel filtracija se provodi na Sephadexu G-100 uz eluiranje s 0,15±0,01 M otopinom natrijum hlorida (pH 4,4-5,0), što vam omogućava da se potpuno riješite zelenkaste nijanse otopine peroksidaze zbog prisutnost klorofila i srodnih spojeva, te tvari s manjim molekularnim veličinama od peroksidaze. U analogu pronalaska, gel filtracija se provodi na Sephadexu G-25, koji je inferioran u odnosu na Sephadex G-100 u svojoj sposobnosti da zadrži čestice nečistoća, uzimajući u obzir veličinu molekula peroksidaze (oko 40 kDa).

Suštinu pronalaska ilustruju sljedeći primjeri.

Primjer 1: Priprema sirovog ekstrakta

50 kg korijena rena se opere pod tekućom vodom i klija 140-160 sati na temperaturi od +25±1°C. Proklijalo korijenje se usitnjava pomoću lopatičnog homogenizatora i puni se sa 50 litara 0,15-0,2 M rastvora natrijum hlorida (pH 4,4±0,2). Suspenzija se ekstrahuje 12±2 sata uz stalno mešanje, a zatim centrifugira.

Amonijum sulfat se dodaje u supernatant-1 zapremine 60 litara da se odvoje balastni proteini uz neprekidno mešanje do 45-48% zasićenja. (Pod 100% zasićenjem podrazumijevamo količinu soli čijim dodavanjem otopina postaje zasićena, a daljnjim dodavanjem soli otopina postaje prezasićena i sol se taloži. Za otopine sa amonijum sulfatom, 100% zasićenje je dodavanje i završeno rastvaranje 70.7 g amonijum sulfata u 100 ml destilovane vode.) Talog-1 se odvaja centrifugiranjem. Zatim se dobijeni supernatant-2 zapremine 55 l zasiti amonijum sulfatom do 85% da bi se istaložila peroksidaza, a talog-2 se odvoji centrifugiranjem. Nastali talog-2 se rastvori dejonizovanom vodom do konačne zapremine od 200±10 ml, a neotopljeni talog-3 se odvoji centrifugiranjem.

Gel kromatografija na Sephadexu G-100.

Rastvor peroksidaze se nanosi na kolonu od 1 L napunjenu Sephadexom G-100. Eluiranje se vrši sa 0,15-0,2 M rastvorom natrijum hlorida (pH 4,4-5,0) brzinom od 100 ml/h tokom eluiranja, biraju se frakcije od 20 ml. U prikupljenim frakcijama se mjeri R Z =D 408 /D 275. Kombinuju se razlomci u kojima je RZ najmanje 0,8.

U zbirku se stavlja 5 litara 5±0,1 mM natrijum acetatnog pufera (pH 4,4-5,0) (pufer-1) i vrećica za dijalizu sa kombinovanim frakcijama peroksidaze. Dijaliza se izvodi uz stalno miješanje 24 sata, tri puta mijenjajući pufer u zbirci.

Osoljeni rastvor enzima se nanosi na kolonu od 1 L napunjenu karboksimetilcelulozom i uravnotežuje puferom-1. Eluiranje se vrši brzinom od 50 ml/h u linearnom gradijentu od 5 mM-0,1 M acetatnog pufera (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Vrijednost RZ se mjeri u proteinskim frakcijama. Kombinuju se razlomci u kojima je vrijednost R Z najmanje 2,5.

U zbirku se stavlja 5 litara 20±0,1 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 8,0±0,1) (pufer-2) i vrećica za dijalizu sa kombinovanim frakcijama enzima. Dijaliza se provodi na isti način.

Koncentrirajuća hromatografija na DEAE-celulozi.

Rastvor enzima sa pH od 8,0 ± 0,1 se nanosi na kolonu od 300 ml napunjenu DEAE celulozom. Eluiranje se vrši puferom-2 brzinom od 50 ml/h. Kombinuju se razlomci u kojima je vrijednost R Z najmanje 3,0.

U zbirku se stavlja 5 litara deionizirane vode i vrećica za dijalizu s otopinom peroksidaze. Dijaliza se provodi na isti način.

Sušenje zamrzavanjem.

Otopina peroksidaze se prenosi u sterilnu tikvicu otpornu na toplinu, zamrzava tečnim dušikom i suši zamrzavanjem dok se lijek potpuno ne osuši.

Primjer 2 (uporedni)

U ovom primeru su ispunjeni uslovi za dobijanje peroksidaze prema prototipu, ali da bi se poboljšali glavni parametri peroksidaze menjaju se dve postojeće faze u prototipu, i to: za ultrafiltracionu koncentraciju rastvora peroksidaze, dve vrste kolona sa šupljim Koriste se vlakna, za razliku od prototipa, gde se koristi jedna vrsta vlakana, i frakciono frakcionisanje proteina sa solima amonijum sulfata (kao u traženoj metodi).

Dobivanje sirovog ekstrakta.

50 kg korijena hrena se opere pod mlazom vode i oguli do 1/3 mase u prisustvu 33,5 litara 0,25% otopine askorbinske kiseline za hranu, u kojoj se dobiveno čišćenje drži 1 sat da se ekstrahira peroksidaza. enzim. Zatim se ekstrakt centrifugira u protočnoj centrifugi i drži 24 sata da "sazre" enzim.

Primarno pročišćavanje i koncentracija.

Dobijenom ekstraktu se dodaje 1,7 kg (5% po masi) natrijum sulfita i ekstrakt se podvrgava koncentraciji i primarnom prečišćavanju ultrafiltracijom pomoću instalacije sa šupljim polimernim vlaknima UPV-6, opremljene kolonama sa filterima veličine pora od 60 kDa i 5 kDa. Šematski dijagram instalacija je prikazana na slici 2, koja prikazuje centrifugalnu pumpu 1; predfilter 2; kolona s vlaknima veličine pora od 60 kDa 3; kolona s vlaknima veličine pora od 5 kDa 4; filtrat peroksidaze 5; koncentrirani rastvor peroksidaze 6; filtrat koji sadrži proteine ​​niske molekularne težine 7.

Frakcionisanje proteina sa solima amonijum sulfata.

Amonijum sulfat se dodaje u koncentrat od 6 litara da se odvoje balastni proteini uz neprekidno mešanje do 45-48% zasićenja. Talog se odvaja centrifugiranjem. Zatim se dobijeni supernatant zapremine 5,7 litara za taloženje peroksidaze zasiti amonijum sulfatom do 85%, talog se odvoji centrifugiranjem, koji se rastvori dvostruko destilovanom vodom do konačnog volumena od 200 ± 10 ml, neotopljeni talog se odvaja centrifugiranjem.

Gel kromatografija na Sephadexu G-25 i G-50.

Dalje prečišćavanje peroksidaze se vrši na koloni za gel filtraciju napunjenoj Sephadexom G-25 i ekvilibriranom bidestiliranom vodom. Rastvor peroksidaze se nanosi na kolonu, eluiranje se vrši bidestiliranom vodom. Prikupiti razlomke u kojima RZ nije manji od 0,2. Sakupljenim frakcijama dodaje se amonijum sulfat dok se ne postigne zasićenje od 90%, miješa se dok se sol potpuno ne otopi i centrifugira. Talog se rastvori u 3 puta većoj zapremini bidestilovane vode i nanese na kolonu za gel filtraciju napunjenu Sephadexom G-50 i uravnoteženu sa bidestilovanom vodom. Eluiranje se vrši bidestilovanom vodom. Sakupiti razlomke u kojima RZ nije manji od 0,6. Korištenjem 50% octene kiseline, pH vrijednost u frakcijama peroksidaze se podešava na 4,4.

Kromatografija na karboksimetilcelulozi.

Frakcije peroksidaze su naslagane na kolonu od 1 L napunjenu karboksimetilcelulozom, prethodno ekvilibriranu sa 5 mM acetatnim puferom pH 4,4. Eluiranje je izvedeno linearnim gradijentom od 5 mM-0,15 M acetatnog pufera (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l) tokom 1 sata. Vrijednost RZ se mjeri u proteinskim frakcijama. Kombinuju se frakcije u kojima vrijednost RZ nije manja od 2,7, pH se podesi na 5,0 dodavanjem amonijaka i osuši smrzavanjem.

Uporedni podaci za primjere 1 i 2 dati su u tabeli.

Table Uporedni podaci o glavnim parametrima kvaliteta peroksidaze iz korijena hrena primjenom dva načina proizvodnje.
Naziv tehnološkog parametra, mjerna jedinica.	Primjer 1 (zatražena metoda)	Primjer 2 (poznata metoda)
Prinos po težini peroksidaze, g/kg korijena rena.	2,52-3,50	0,21-0,85
Specifična aktivnost lijeka, E.A./mg proteina*	640-700	560-610
Čistoća spektrofotometra R Z =D 408 /D 275	3,00-3,20	2,70-3,00
* - Specifična aktivnost je izračunata na osnovu podataka datih u STP 103.34-83. Pravila za izračunavanje i obradu rezultata kvantitativne analize. NIKTI BAV, 1983.

Dakle, kao što se može vidjeti iz primjera i tabele, predložena metoda za dobijanje peroksidaze iz korijena hrena (primjer 1) omogućava dobijanje peroksidaze u visokim prinosima, čistoće i aktivnosti dovoljne za korištenje ovog enzima kao komponenta konjugata za enzimske imunosorbentne testove. A u uslovima prototipa (primer 2), čak i uz poboljšanje dve faze koje poboljšavaju performanse, prinos, specifična aktivnost i čistoća ciljne peroksidaze su niži od onih kod predložene metode.

Ova metoda se može koristiti u industrijskoj proizvodnji peroksidaze iz korijena hrena.

FORMULA PRONALASKA

1. Metoda za dobijanje enzima peroksidaze iz korena hrena, uključujući drobljenje i homogenizaciju proklijalog korena hrena, ekstrakciju homogenizata korena rena, odvajanje balastnih proteina i taloženje peroksidaze solima amonijum sulfata, gel filtraciju rastvora peroksidaze na Sephadexu, hromatografsko prečišćavanje na karboksimetilcelulozi, sušenje zamrzavanjem ciljne peroksidaze, karakteriše to što se zdrobljeni koreni hrena ekstrahuju sa 0,15±0,01 M rastvorom natrijum hlorida; Gel filtracija rastvora peroksidaze se vrši na Sephadexu G-100, dijaliza se vrši protiv natrijum acetatnog pufera sa pH 4,4-5,0 i dijaliza protiv kalijum fosfatnog pufera sa pH 8,0±0,1 i koncentriranje uz dodatno prečišćavanje na DEAE -celulozi sa eluiranje istim puferom nakon čega slijedi dijaliza protiv deionizirane vode.

2. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time što se zgnječeni korijen rena ekstrahuje sa 0,15±0,01 M rastvorom natrijum hlorida sa pH od 4,4±0,2.

3. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što se precipitacija proteina sa solima amonijum sulfata koristi dva puta: 45-48% zasićenja se koristi za odvajanje balastnih proteina, a 85-90% zasićenja se koristi za taloženje peroksidaze.

4. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što se gel filtracija izvodi na Sephadex G-100 uz eluiranje sa 0,15-0,2 M rastvorom natrijum hlorida sa pH 4,4-5,0.

5. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što hromatografskom prečišćavanju peroksidaze na karboksimetilcelulozi prethodi dijaliza protiv natrijum acetatnog pufera sa pH 4,4-5,0.

6. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što sušenju zamrzavanjem prethodi dijaliza rastvora peroksidaze protiv dejonizovane vode.

• Specijalnost Visoke atestacijske komisije Ruske Federacije03.00.23
• Broj strana 106

II. PREGLED LITERATURE.

Poglavlje 1. STRUKTURA, MEHANIZAM DJELOVANJA I NOVE PRIMJENE NATIVNIH I REKOMBINANTNIH PEROKSIDAZA.

1.1. Uvod.

1.2. Kristalne strukture peroksidaza.

1.3. Kiselinsko-bazna kataliza peroksidaza.

1.4. Mesta za vezivanje metala.

1.5. Arhitektura HRP aktivnog centra.

1.5.1. Struktura distalne regije HRP i sistema vodoničnih veza.

1.5.2. Struktura proksimalnog regiona HRP i sistema vodoničnih veza.

1.5.3. Vezivno mjesto za aromatične supstrate.

1.6. Uloga proteinske sredine u katalizi peroksidaze.

Poglavlje 2. BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA PEROKSIDAZA.

2.1 Upotreba peroksidaza u enzimskoj analizi.

2.2. Biohemijska analiza fiziološki aktivnih supstanci.

2.3. Upotreba peroksidaza u biosenzorima.

2.4. Primjena peroksidaza u biotransformacijama.

2.5. Upotreba peroksidaza za biobijeljenje u industriji celuloze i papira.

Poglavlje 3. IZOLACIJA, RENATURACIJA I FORMIRANJE

DISULFIDNE VEZE EUKARIOTSKIH PROTEINA IZRAŽENE U ĆELIJAMA E.coli U INKLUZIJSKIM TIJELIMA.

III. EKSPERIMENTALNI DIO.

Poglavlje 4. MATERIJALI I METODE.

4.1. Reagensi.

4.2. Metode istraživanja.

4.2.1 Kloniranje rekombinantnih oblika HRP-a.

4.2.2 Priprema rekombinantnog konjugata HRP sa BPFA.

4.2.3 Ekspresija rekombinantnog HRP-a u ćelijama E.coli.

4.2.4 Protokoli za ponovno presavijanje i pročišćavanje rekombinantnog HRP-a.

4.2.5 Fizičko-hemijska svojstva rekombinantnih oblika HRP.

4.2.6 Adsorpcijska i elektrohemijska mjerenja.

4.2.7 Proračun strukturnih promjena u mutantnim oblicima peroksidaze hrena.

IV. REZULTATI I NJIHOVA DISKUSIJA.

Poglavlje 5. IZRAŽAVANJE REKOMBINANTNE PEROKSIDAZE TROŠKA

U E.coli ĆELIJAMA: OPTIMIZACIJA SISTEMA IZRAŽAVANJA, REFOLDING, REAKTIVACIJA I PROČIŠĆAVANJE.

5.1. Ekspresija HRP u periplazmatskom području ćelija E. coli BL21(DE3).

5.2. Optimizacija sistema za ponovno namotavanje HRP-a iz inkluzijskih tijela kada se ekspresira u citoplazmatski region E. coli BL21(DE3)pLysS ćelija.

5.3. Osobine rekombinantnog HPC 6xHis na C-kraju.

5.4. Priprema i svojstva mutantnih oblika HRP-a.

Poglavlje 6. ZASNOVANI NA AMPEROMETRIJSKIM SENZORIMA

REKOMBINANTNI OBLICI HRP.

6.1 Amperometrijsko određivanje H2O2.

6.2 Stabilnost signala biosenzora.

6.3 Razvoj bienzimskih biosenzora.

Poglavlje 7. PRIPREMA I SVOJSTVA REKOMBINANTNOG KONJUGATA

PEROKSIDAZA HRENA SA BPFA.

7.1 Kloniranje i ekspresija rekombinantnog HRP-BPFA konjugata u ćelijama E. coli.

7.2 Fizičko-hemijska i imunološka svojstva rekombinantnog PC-BPZHK konjugata.

V. ZAKLJUČCI.

Preporučena lista disertacija

• Enzimski imunotest proteina koji vezuje masne kiseline na bazi rekombinantnih reagensa 2004, Kandidat hemijskih nauka Andreeva, Irina Petrovna

• Rekombinantna duhanska peroksidaza: priprema i katalitička svojstva 2007, Kandidat hemijskih nauka Khušpuljan, Dmitrij Mihajlovič

• Stvaranje i proučavanje svojstava rekombinantnih humanih proteina sa potencijalnim antitumorskim dejstvom 2007, Kandidat hemijskih nauka Savvateeva, Ljudmila Vladimirovna

• Konformacijske razlike između nativnih i rekombinantnih oblika izoenzima C peroksidaze hrena, otkrivene radiohemijskim i kinetičkim metodama

• Proučavanje organizacije fosfat-vezujuće regije bakterijskih uridin fosforilaze 2000, kandidat bioloških nauka Čebotajev, Dmitrij Vladimirovič

Uvod u disertaciju (dio apstrakta) na temu “Priprema, svojstva i primjena rekombinantne peroksidaze hrena”

Izoenzim C peroksidaze hrena (EC 1.11.1.7) je glikoprotein, molekulska težina 44 kDa, pripada superfamiliji biljnih peroksidaza, sadrži prostetičku grupu protoporfirin-IX, dva Ca2+ jona. HRP katalizira jednoelektronsku oksidaciju veliki broj organske i anorganske podloge sa vodikovim peroksidom. HRP je pronašao široku upotrebu u analitičkoj biohemiji i biotehnologiji kao marker za antitijela, DNK i niskomolekularne spojeve (analiti).

IN poslednjih godina Napredak postignut u kloniranju i heterolognoj ekspresiji HRP gena otvara nove mogućnosti za proučavanje odnosa strukture i funkcije primjenom metoda proteinskog inženjeringa.

Da bi se dobio rekombinantni HRP, sistem ekspresije u ćelijama E.coli našao je široku upotrebu. Postoje i druge metode ekspresije, kao što je ekspresija u ćelijama insekata, koja proizvodi enzim u aktivnom, rastvorljivom i glikozilovanom obliku, i ekspresija u kvascu. Međutim, ovi sistemi ekspresije su prilično skupi i radno intenzivni, osim toga, sistem ekspresije u ćelijama insekata ne može se povećati, tako da nisu našli tako široku distribuciju kao ekspresija u ćelijama E. coli.

Rekombinantni HRP se eksprimira u ćelijama E. coli u nerastvorljivom, neaktivnom obliku u inkluzijskim tijelima. Proces ponovnog savijanja i reaktivacije apo-peroksidaze od strane protetske grupe je višestepeni i prilično radno intenzivan.

Za aplikacije kao što su biosenzori, efikasniji i pouzdan način dobivanje rekombinantnog HRP-a. Stoga je jedan od glavnih ciljeva ovog rada bio pronalaženje načina za optimizaciju prethodno opisanih protokola za ponovno savijanje, reaktivaciju i pročišćavanje rekombinantnog HRP-a, kao i proučavanje mogućnosti periplazmatske ekspresije za dobijanje rastvorljivog, aktivnog enzima.

Visoka katalitička aktivnost HRP-a u reakciji redukcije vodikovog peroksida omogućava korištenje peroksidaze kao visoko efikasnog bioelektrokatalizatora uključenog u direktan prijenos elektrona između elektrode, aktivnog centra enzima i supstrata. U prisustvu supstrata na određenom elektrodnom potencijalu, uočava se proporcionalnost između izmjerene redukcijske struje i koncentracije H2O2. Istovremeno, efikasnost direktnog (transfera elektrona bez medijatora) jedan je od najvažnijih uslova za razvoj amperometrijskih biosenzorskih sistema baziranih na HRP. Iz svega navedenog organski proizlazi sljedeći cilj ovog rada - modifikacija površine rekombinantnog HRP metodom mutageneze usmjerene na mjesto. funkcionalne grupe kako bi se osigurala efikasna usmjerena imobilizacija HRP molekula na površini elektroda. U radu je predložena strategija za uvođenje kratkih oligohistidinskih sekvenci u površinske regije HRP-a, koja bi, s jedne strane, trebala osigurati efikasno pročišćavanje rekombinantnog enzima metalnom helatnom hromatografijom (Ni-NTA agaroza), a istovremeno promovirati efikasna adsorpcija odgovarajućih mutanata na površinskim zlatnim elektrodama (poznato je da su histidini nepovratno sorbirani na zlatu).

Peroksidaza hrena je našla široku upotrebu kao marker enzima za enzimski imunotest. Hemijska konjugacija proteina i haptena dovodi do djelomične inaktivacije enzima i heterogenosti konjugata, što zauzvrat utiče na specifičnost i osjetljivost analize.

Sa razvojem genetski inženjering postalo je moguće stvoriti rekombinantne konjugate markerskog enzima s antitijelima i proteinskim antigenima. Takvi konjugati imaju niz prednosti u odnosu na hemijski dobijene, a posebno su homogeni po sastavu, imaju stehiometriju 1:1 i ponovljivi. Osim toga, rekombinantni konjugati zadržavaju 100% enzimsku i imunološku aktivnost.

Nedavni napredak u heterolognoj ekspresiji HRP-a u ćelijama E. coli i reaktivaciji rekombinantne peroksidaze hrena omogućavaju dobijanje rekombinantnih konjugata sa peroksidazom kao markerskim enzimom i njihovu upotrebu u enzimski vezanim imunosorbentnim testovima. Cilj ove faze rada bio je da se dobije rekombinantni konjugat peroksidaze rena sa proteinom koji vezuje masne kiseline tipa srca (FABP). BPFA je novi visoko specifičan marker infarkta miokarda. Proizvodnja rekombinantnog konjugata HRP sa BPFA omogućiće stvaranje novih brzih sistema za dijagnostiku infarkta miokarda.

II. PREGLED LITERATURE

Slične disertacije na specijalnosti "Biotehnologija", 03.00.23 šifra VAK

• Konformacijske razlike između nativnih i rekombinantnih oblika izoenzima C peroksidaze hrena, otkrivene radiohemijskim i kinetičkim metodama 2002, kandidat hemijskih nauka Chubar, Tatyana Anatolyevna

• Rekombinantni analozi acilaze glutaril-7-aminocefalosporanske kiseline iz bakterije Brevundimonas diminuta 2009, kandidat bioloških nauka Zakirova, Svetlana Anatoljevna

• Priprema rekombinantnih proteina iz zapadnosibirskih izolata Borrelia burgdorferi sensu lato i proučavanje njihovih antigenskih svojstava 2009, Kandidat bioloških nauka Rjabčenko, Aleksandar Vladimirovič

• Povećanje antitumorske aktivnosti TRAIL citokina promjenom sastava aminokiselina proteina 2010, kandidat bioloških nauka Yagolovich, Anna Valerievna

• Upotreba beta-helikalnog domena i peptidil-prolil izomeraze za proizvodnju fibrilnog adhezina bakteriofaga T4 2012, Kandidat bioloških nauka Čuprov-Netočin, Roman Nikolajevič

Zaključak disertacije na temu "Biotehnologija", Grigorenko, Vitalij Georgijevič

1. Kada se rekombinantna peroksidaza hrena ekspresira u replazmu ćelija E. coli soja BL21(DE3) sa ekspresijskim vektorom pETpelHRPhis, formira se rastvorljivi, funkcionalno aktivan enzim sa ukupnim prinosom od oko 0,5 mg proteina po 1 litri ćelije. kulture.

2. Citoplazmatski sistem za ekspresiju rekombinantnog HRP u ćelijama E. coli, soj BL21(DE3)pLysS sa ekspresijskim vektorom pETHRPhis, obezbeđuje visok nivo ekspresije HRP u obliku inkluzijskih tela (ciljani proizvod je oko 30). % ukupnog ćelijskog proteina ćelije). Uvođenje heksahistidinske sekvence (6xHis) u C-terminalnu regiju HRP-a omogućilo je efikasnu hromatografiju metalnog helata da izoluje i pročisti preparat rekombinantnog enzima.

3. Na osnovu podataka o uticaju različitih reagenasa (uree, imidazola, glutationa, itd.) na svojstva HRP-a, a nova šema ponovno savijanje i reaktivacija rekombinantnog HRP-a iz inkluzijskih tijela, omogućavajući dobivanje aktivnog holo-enzima s prinosom od 8-10 mg po 1 litri kulture E. coli.

4. Pokazalo se da je uvođenje heksahistidinskih sekvenci u N- i C-terminalne regije enzima, kao i zamjena mutagenezom usmjerenom na mjesto aminokiselinskih ostataka dvaju unutrašnjih površinskih regija (57-61) i (211-216) sa histidinskim, respektivno, utiče na katalitička svojstva rekombinantnog HRP-a.

5. Zlatne elektrode modificirane rekombinantnim oblicima HRP-a pokazuju visok i stabilan amperometrijski signal za bioelektrokatalitičku redukciju H2O2 zbog efektivnog direktnog prijenosa elektrona između površine zlata i aktivnog centra enzima, koji služi kao osnova za stvaranje univerzalni senzor za H2O2, kao i za stvaranje bienzimskih senzora zasnovanih na koimobilizaciji HRP i odgovarajućih oksidaza koje stvaraju H2O2 (lizin oksidaza, glukoza oksidaza itd.).

6. Rekombinantni konjugat peroksidaze rena sa proteinom za transport masnih kiselina iz ljudskog srca (BPFA) ima i katalitička svojstva HRP-a i imunogena svojstva BPFA, što omogućava njegovu upotrebu u enzimskim imunosorbentnim testovima. Prinos ciljnog proizvoda bio je 12 mg po 1 litri kulture E. coli.

Spisak referenci za istraživanje disertacije Kandidat hemijskih nauka Grigorenko, Vitalij Georgijevič, 2001

1. Welinder, K.G. (1992) Superfamilija biljnih, gljivičnih i bakterijskih peroksidaza. Curr. Opin. Struktura. Biol., 2:388-393.

2. Dunford, H.B. i Stillman, J.S. (1976) O funkciji i mehanizmu djelovanja peroksidaza, Coordination Chemistry Reviews, 19, 187-251

3. English, A.M., Tsaprailis, G. (1995) Odnosi katalitičke strukture i funkcije u hem peroksidazama. Adv.Inorg. Chem., 43:79-125

4. Welinder, K.G. Kovalentna struktura glikoproteinske peroksidaze hrena (EC1.11.1.7). FEBSLet., 1976. 72: str. 19-25.

5. Dunford, H.B. Peroksidaza hrena: struktura i kinetička svojstva, u Peroksidaza u hemiji i biologiji, J. Everse, K.E. Evers i M.B. Grisham, Urednici. 1992, CRC Press: Boca Raton, Florida, str. 1-24.

6. Kim, B.B. Pisarev, Y.Y. Egorov, A.M. Komparativna studija peroksidaza iz hrena i Arthromyces Ramosus kao oznaka u hemiluminiscentnom testu posredovanom luminolom. Anal.Biochem., 1991. 199: str. 1-6.

7. Chiswell, D.J. i Ortlepp S.A. (1989) DNK sekvenca koja kodira za HRP enzim. Evropski patent br. EP0299682

8. Ortlepp, S.A., Pollard-Knight, D. i Chiswell, D.J. (1989) Ekspresija i karakterizacija proteina specificiranog sintetičkim genom peroksidaze hrena u Escherichia coli. J. Biotech., 11, 353-364.

9. Newmyer, S.L., Sun, J., Loehr, T.M., De Montellano P.R.O. Spašavanje aktivnosti mutanta His-170->Ala peroksidaze hrena imidazolom: Važnost vezivanja proksimalnog liganda. Biochemistry, 1996.35(39): str. 12788-12795.

10. Newmyer, S.L., De Montellano, P.R.O. Spašavanje katalitičke aktivnosti mutanta H42A peroksidaze hrena egzogenim imidazolima. Journal of Biological Chemistry, 1996. 271(25): str. 14891-14896.

11. Tanaka, M., Ishimori, K., Morishima, I. Distalna glutaminska kiselina kao kiselo-bazni katalizator u distalnom mjestu peroksidaze hrena. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996. 227(2): str. 393-399.

12. Howes, B.D., Rodriguezlopez, J.N., Smith, A.T., Smulevich, G. Mutacija distalnih ostataka peroksidaze hrena: Utjecaj na vezivanje supstrata i svojstva šupljine. Biochemistry, 1997.36(6): str. 1532-1543.

13. Holzbaur, I.E., English, A.M., Ismail, A.A. Infracrveni spektar karbonil peroksidaze hrena i njenih supstratnih kompleksa: Karakterizacija pH-ovisnih konformera. Journal of the American Chemical Society, 1996. 118(14): str. 3354-3359.

14. Gilfoyle, D.J., Rodriguezlopez, J.N., Smith, A.T. Ispitivanje mjesta vezanja aromatičnog donora peroksidaze hrena korištenjem mutageneze usmjerene na mjesto i samoubilačkog supstrata fenilhidrazina. European Journal of Biochemistry, 1996. 236(2): str. 714-722.

15. Gazaryan, I.G., Galkin, A.G., Doseeva, V.V., Tishkov, V.I. Proizvodnja i katalitička svojstva Phe41->His i Phel43->Glu jednostrukih mutanata peroksidaze hrena izraženih u E-coli. Biohemija Moskva, 1995. 60(10): str. 1187-1192.

16. Nagano, S., Tanaka, M., Watanabe, Y., Morishima, I. Pretpostavljena mreža vodoničnih veza na distalnom mjestu hema peroksidaze rena. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1995.207(1): str. 417-423.

17. Nagano, S., Tanaka, M., Ishimori, K., Watanabe, Y., Morishima, I. Katalitičke uloge distalnog para asparagin-histidin para u peroksidazama. Biochemistry, 1996. 35(45): str. 14251-14258.

18. Ozaki S., De Montellano, P.R.O. Molekularni inženjering peroksidaze hrena: tioeter sulfoksidacija i stiren epoksidacija mutantima Phe-41 leucina i treonina. Journal of the American Chemical Society, 1995. 117(27): str. 7056-7064.

19. Tarns J.W., Welinder, K.G. Deglikozilacija peroksidaze hrena, u biohemijskim, molekularnim i fiziološkim aspektima biljnih peroksidaza, J. Lobarzewski, et al., Urednici. 1991, Štampa Imprimerie Nationale: Geneve, str. 111-114.

20. Egorov, A.M., Kim, B.B., Pisarev, Y.Y., Kapeliuch, Yu.L., Gazaryan I.G. Temeljni i primijenjeni aspekti reakcije pojačane hemiluminiscencije. u Bioluminiscencija i hemiluminiscencija: Izveštaj o stanju. 1993. Chichester: John Wiley & Sons.

21. Banci, L. Strukturna svojstva peroksidaza. J. Biotechnol., 1997, 53,253-263.

22. Patterson, W.R., Poulos, T.L. (1995) Kristalna struktura rekombinantne citosolne askorbat peroksidaze graška. Biochemistry, 34: 4331-4341

23. Schuller, D.J., Ban N, Van Huystee, R.B., McPherson, A., Poulos, T.L. (1996) Kristalna struktura peroksidaze kikirikija. Struktura, 4:311-321.

24. Gajhede, M., Schuller, D.J., Henriksen, A., Smith, A.T. i Poulos, T.L. (1997) Kristalna struktura peroksidaze C hrena pri rezoluciji 2,15 A. Nature Structural Biology, 4, 12, 1032-1038.

25. Henriksen, A., Welinder, K.G., Gajhede, M. (1998) Struktura peroksidaze zrna ječma rafinisana pri rezoluciji 1,9 A. Biljna peroksidaza se reverzibilno inaktivira pri neutralnom pH. J Biol. Chem., 273, 2241-2248.

26. Savenkova, M.I., Newmyer, S.L., Ortiz de Montellano, P.R. Spašavanje His42-Ala peroksidaze hrena pomoću Phe41-His mutacije. Inženjering surogat katalitičkog histidina. J.Biol.Chem. 1996, 271, 24598-24603.

27. Tanaka, M., Ishimori, K., Mukai, M., Kitagawa, T., Morishima, I. Katalitičke aktivnosti i strukturna svojstva peroksidaze hrena distalnog His42-Glu ili Gin mutanta. Biochemistry, 1997, 36, 9889-9898.

28. Tanaka, M., Nagano, S., Ishimori, K., Morishima, I., (1997) Mreža vodoničnih veza na distalnom mjestu peroksidaza: Spektroskopska svojstva Asn70-Asp mutanta peroksidaze hrena. Biochemistry, 36, 9791-9798.

29. Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T., Thorneley, R.N.F., (1996.) Uloga Arg38 u peroksidazi hrena. Kritični ostatak za vezivanje supstrata i katalizu. J Biol. Chem., 271, 4023-4030.

30. Folkes, L.K., Candeas, L.P. (1997) Interpretacija reaktivnosti jedinjenja peroksidaze I i II sa fenolima Marcusovom jednačinom. FEBS Lett., 412, 305-308.

31. Nie, G.J., Aust, S.D. (1997) Spektralne promjene lignin peroksidaze tokom reverzibilne inaktivacije. Biochemistry, 36, 5113-5119.

32. Smulevich, G. et.al. (1994) Karakterizacija rekombinantne peroksidaze rena C i tri mutanta usmjerena na mjesta, F41V, F41W i R38K rezonantnom Ramanovom spektroskopijom. Biochemistry, 33, 7398-7400.

33. Veitch, N.C. & Williams, R.J.P. (1990) Dvodimenzionalne "H-NMR studije ren peroksidaze C i njene interakcije sa indol-3-propionskom kiselinom. Eur. J. Biochem., 189, 351-362.

34. Ruzgas T., Gorton L., Emneus J., Marco-Varga G. (1995) Kinetički modeli djelovanja peroksidaze hrena na grafitnu elektrodu, J. Electroanal. Chem., 391,41-49.

35. Lindgren A., Tanaka M., Ruzgas T., Gorton L., Gazaryan I., Ishimori K., Morishima I. (1999) Direktan prijenos elektrona kataliziran rekombinantnim oblicima peroksidaze hrena: uvid u mehanizam. Electrochem. Commun., 1, 171-175.

36. Presnova, G., Grigorenko, V., Egorov, A., Ruzgas T., Lindgren A., Gorton L., Borchers, T., (2000), Direktan heterogeni transfer elektrona rekombinantnih peroksidaza hrena na zlato. Faraday Discuss., 116, 281-289

37. Ferapontova, E.E., Grigorenko, V.G., Egorov, A.M., Borchers, T., Ruzgas T., Gorton L., (2001) Direct Electron Transfer in the SystemGold Electrode-Recombinant Horseradish Peroxidases. J.Electroan. Chem.

38. Lindbladh, C.; Mosbach, K.; Bulow, L. (1993), Upotreba genetski pripremljenih enzimskih konjugata u enzimskom imunoeseju. Trends Biochem. Sci., 8, 279-283.

39. Porštanin. T.; Kiessig, S. T. J. (1992) Tehnike enzimskog imunoeseja. Pregled.

40. J. Immunol. Metode, 150, 5-21.

41. Wittkowski, A.; Daunert, S.; Kindy, M. S.; Bachas, L. G. (1993), Enzimski imunosorbentni test za oktapeptid zasnovan na genetski modifikovanom fuzionom proteinu. Anal. Chem., 65, 1147-1151.

42. Schreiber, A.; Specht, V.; Pelsers, M. M. A. L.; Glatz, J. F. C.; Borchers, T.; Spener, F. (1998) Rekombinantni humani protein koji vezuje masne kiseline tipa srca kao standard u imunohemijskim testovima. Clin. Chem. Lab. Med., 36,283-288.

43. Grigorenko VG, Chubar TA, Kapeliuch YuL, Borchers T, Spener, F. i Egorov, A.M., (1999) Novi pristupi za funkcionalnu ekspresiju rekombinantne peroksidaze C hrena u Escherichia Coli., Biokataliza i biotransformacija, 17, 37-3959 .

44. Grigorenko, V., Andreeva, I., Borchers, T., Spener, F. i Egorov A.M. Genetski modifikovan fuzioni protein sa peroksidazom hrena kao marker enzimom za upotrebu u kompetitivnim imunotestovima. (2001) Anal.Chem., 73, 11341139.

45. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. i Dubendorf, J.W. (1990) Upotreba T7 RNA polimeraze za usmjeravanje ekspresije kloniranih gena. Metode u enzimologiji, 185, 60-89.

46. ​​George, P. (1953) Hemijska priroda drugog jedinjenja vodikovog peroksida formiranog od citokroma s peroksidazom i peroksidazom hrena. Biochemical Journal, 54, 267-271.

47. Bradford, M.M. (1976) Brza i osjetljiva metoda za kvantifikaciju mikrogramskih količina proteina koristeći princip vezivanja protein-boja. Analytical Biochemistry, 72, 248-254

48. Fuhrhop, J.-H. i Smith, K.M. (1975) Laboratorijske metode. U Porphyrins and Metalloproteins (ur. K. M. Smith). Elsevier, Amsterdam, str. 757-869.

49. Laemmli, U.K. (1970) Cepanje strukturnih proteina tokom sastavljanja glave bakteriofaga T4. Nature, 227, 680-685.

50. Hartmann, C., Ortiz de Montellano, P.R. (1992) Ekspresija bakulovirusa i karakterizacija katalitički aktivne peroksidaze hrena. Arhiv za biohemiju i biofiziku, 297, 61 -72.

51. Morawski V., Lin Z, Cirino P., Joo H, Bandara G, Arnold F.H. (2000) Funkcionalna ekspresija peroksidaze hrena u Saccharomyces cerevisiae i Pichiapastoris. Protein. inž., 13(5), 377-84.

52. Freedman, R.B. (1995) Formiranje proteinskih disulfidnih veza. Current Opinion in Structural Biology, 5, 85-91.

53. Skerra, A. i Pliickthun, A. (1988) Sastavljanje funkcionalnog imunoglobulinskog Fv fragmenta u Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.

54. Le, H. V. i Trotta, P.P. (1991) Pročišćavanje izlučenih rekombinantnih proteina iz Escherichia coli. Bioprocess Technology, 12,163-181.

55. Gillet, D., Ducancel, F., Pradel, E., Leonetti, M., Menez, A. i Boulain, J.C. (1992) Umetanje neurotoksina koji sadrži disulfide u alkalnu fosfatazu E. coli: hibrid zadržava obje biološke aktivnosti. Protein Engineering, 5, 273-278.

56. Ouzzine, M., Boyd, A. i Hulmes, D.J. (1996) Ekspresija aktivne ljudske lizil oksidaze u Escherichia coli. Pisma FEBS-a, 399, 215-219.

57. Berezin, I.V., Ugarova, N.N., Kershchengolts, B.M., Brovko, L.I.U. (1975) Utjecaj prostetske grupe peroksidaze hrena na stabilnost enzima (na ruskom) Biokhimiia 40, 297-301

58. Hargrove, M.S., Krzywda, S., Wilkinson, A.J., Dou, Y., Ikeda-Saito, M. i Olson, J.S. (1994) Stabilnost mioglobina: model za savijanje proteina hema. Biochemistry, 33, 11769-11775.

59. Tams J.W. i Welinder K. G. (1995) Blaga hemijska deglikozilacija peroksidaze rena daje potpuno aktivan, homogen enzim. Analytical Biochemistry, 228, 48-55

60. Smith, A.T. Santana, N., Dacey, S., Edwards, M., Bray, R.C., Thorneley, R.N.F. i Burke, J.F. (1990) Ekspresija sintetičkog gena za peroksidazu hrena

61. C u Escherichia coli i savijanje i aktivacija rekombinantnog enzima sa 2+

62. Ca i hem. Journal of Biological Chemistry, 265, 1335-13343.

63. Howes, B.D., Rodriguez-Lopez, J.N., Smith, A.T. i Smulevich, G. (1997) Mutacija distalnih ostataka peroksidaze hrena: uticaj na vezivanje supstrata i svojstva šupljine. Biochemistry, 36, 1532-1543.

64. Dalton, D.A., Diaz del Castillo, L., Kahn, M.L., Joyner, S.L. i Chatfield, J.M. (1996) Heterološka ekspresija i karakterizacija citosolne askorbat peroksidaze soje. Arhiv za biohemiju i biofiziku, 328, 1-8.

65. Phelps, S., Antonini, E. (1969) Kombinacija ugljičnog monoksida-hema s apoperoksidazom. Biochemical Journal, 114, 719-724.

66. Rubcova, M.Y., Kovba, G.V. i Egorov, A.M. (1998) Hemiluminiscentni biosenzori na bazi poroznih nosača imobilizirane peroksidaze. Biosenzori i bioelektronika, 13, 75-85.

67. Nakane P.K., Pierce G.B. (1967) Enzimom obeležena antitela za svetlosnu i elektronsko mikroskopsku lokalizaciju tkivnih antigena. J. Cell Biol., 33, 307-318.

68. Avrameas S., Uriel J. (1966) Metoda obilježavanja antigena i antitijela enzimima i njegova imunodifuzijska primjena. CR Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545.

69. Miles L.E. (1968) Obeležena antitela i sistemi imunološkog testa. Nature, 219, 186-189.

70. Engvall E., Perlmann P. (1971) Enzimski imunosorbentni test (ELISA). Kvantitativni test imunoglobulina G. Immunochemistry, 8, 871-874.

71. Frey A., DiGanzio J, Zurakowski D. (1998) Statistički definisana metoda određivanja titra krajnje tačke za imunotestove. J. Immunol. Metode, 221, 35-41.

72. Farr A.J., Nakane P.K. (1981) Imunohistohemija sa enzimom obeleženim antitelima: kratak pregled. J. Immunol. Metoda, 47, 129-144.

73. Ishikawa E., Imagawa M., Hashida S., Yoshitake S., Hamaguchi Y., Ueno T. (1983.) Enzimsko obilježavanje antitijela i njihovih fragmenata za enzimski imunoesej i imunohistohemijsko bojenje. J. Immunoassay, 4, 209-327.

74. Pundir C.S., Kuchhal N.K., Bhargava A.K. (1998) Određivanje oksalata u urinu sa oksalat oksidazom i peroksidazom imobilisanim na staklene perle. Biotechnol. Appl. Biochem., 27, 103-107.

75. Kuhlmann W.D., Pesche P. (1986.) Glukoza oksidaza kao oznaka u histološkim imunotestovima sa enzimskom amplfikacijom u tehnici u dva koraka: koimobilizirana peroksidaza hrena kao sekundarni enzimski sistem za oksidaciju hromogena. Histochemistry, 85, 13-17.

76. Trivedi R.C., Rebar L., Berta E., Stong L. (1978) Nova enzimska metoda za serumsku mokraćnu kiselinu na 500 nm. Clin. Chem., 24, 1908-1911.

77. Ternaux J.P., Chamoin M.C. (1994) Poboljšani hemiluminiscentni testovi za acetilholin. J. Biolumin. Chemilumin., 9, 65-72.

78. Guo J.A., Mo P.S., Li G.X. (1990) Imobilizacija glukoza oksidaze i peroksidaze i njihova primjena u flow-injection analizi glukoze u serumu. Appl. Biochem. Biotechnol., 23, 15-24.

79. Elekes O., Moscone D., Venema K., Korf J. (1995) Bi-enzimski reaktor za elektrohemijsku detekciju niskih koncentracija mokraćne kiseline i glukoze. Clin. Chim. Acta., 239, 153-165.

81. Zhao J., Henkens R.W., Crumbliss A.L. (1996) Amperometrijsko određivanje toksičnih supstanci bez medijatora na osnovu njihove inhibicije imobilizirane peroksidaze hrena. Biotechnol. Prog., 12, 703-708.

82. Ruzgas T., Csoregi E., Emneus J., Gorton L., Marko-Varga G. (1996) Peroxidase-modified electrodes: Fundamentals and applications. Anal. Chim. Acta, 330, 123-138.

83. Ferri T., Poscia A., Santucci R. (1998) Direktna elektrohemija peroksidaze hrena uhvaćene u membranu. Dio II: Amperometrijska detekcija vodikovog peroksida.,

84. Bioelectrochem. Bioenerg., 45, 221-226.

85. Wang B, Li B, Wang Z, Xu G, Wang Q, Dong S (1999) Sol-gel tankoslojni imobilizirani biosenzor sojine peroksidaze za amperometrijsko određivanje vodonik peroksida u kiseloj sredini. Anal. Chem., 71, 1935-1939.

86. Adam W, Lazarus M, Saha-Moller CR, Weichold O, Hoch U, Haring D, Schreier P (1999) Biotransformacije sa peroksidazama. U: Adv Biochem Engineering Biotechnology, Th Scheper, ur., Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 63,73-108.

87. Doerge DR, Divi RL, Churchwell MI (1997) Identifikacija obojenog proizvoda oksidacije gvajakola proizvedenog od strane peroksidaza. Anal. Biochem., 250, 1017.

88. Colonna S., Gaggero N., Richelmi C., Pasta P. (1999) Nedavna biotehnološka dostignuća u upotrebi peroksidaza. Trends Biotechnol., 17, 163-168.

89. Thomas J.A., Morris D.R., Hager .LP. (1970) Chloroperoxidase. Formiranje peroksidnih i halogenih kompleksa i njihov odnos prema mehanizmu reakcije halogenacije. J Biol. Chem., 245, 3129-3142.

90. Dawson J, H, (1988) Ispitivanje odnosa strukture i funkcije u oksigenazama i peroksidazama koje sadrže hem. Science, 240,433-439.

91. Ortiz De Montellano P.R. (1992) Katalitička mjesta hemoprotein peroksidaza. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 89-107.

92. Ricard J., Job D. (1974) Reakcioni mehanizmi degradacije indol-3-acetata peroksidazama. Spektroskopska studija zaustavljenog toka i niske temperature. Eur. J. Biochem., 44, 359-374.

93. Smith A.M., Morrison W.L., Millham P.J. (1982) Oksidacija indol-3-octene kiseline peroksidazom: uključivanje redukovane peroksidaze i spoja III sa superoksidom kao produktom. Biochemistry, 21,4414-4419.

94. Nakajima R., Yamazaki I. (1979) Mehanizam oksidacije indol-3-acetatne kiseline peroksidazama hrena. J Biol. Chem., 254, 872-878.

95. Mottley C, Mason RP (1986) Studija elektronske spin rezonancije slobodnih radikala međuprodukta u oksidaciji indol sirćetne kiseline peroksidazom hrena. J Biol. Chem., 261, 16860-16864.

96. Dordick J.S., Klibanov A.M., Martella M.A. (1986) Hidroksilacije katalizirane peroksidazom hrena: mehaničke studije. Biochemistry, 25, 2946-2951.

97. Kauffmann C., Petersen B.R., Bjerrum M.J. (1999) Enzimsko uklanjanje fenola iz vodenih rastvora pomoću Coprinus cinereus peroksidaze i vodikovog peroksida. J. Biotechnol., 73, 71-74.

98. Al-Kassim L., Taylor K.E. (1994) Enzimsko uklanjanje odabranih aromatičnih zagađivača iz otpadne vode pomoću gljivične peroksidaze iz Coprinus macrorhizus u šaržnim reaktorima. J. Chem. Tech. Biotechnol., 61, 179-182.

99. Saharov I.Yu., Castillo J.A., Areza J.C., Galaev I.Yu. (2000) Prečišćavanje i stabilnost peroksidaze afričke uljane palme Elaies guineensis. Bioseparation, 9, 125-132.

100. Ferrari R.P., Laurenti E., Trotta F. (1999.) Oksidativna 4-dekloracija 2,4,6-triklorofenola katalizirana peroksidazom hrena. J Biol. Inorg. Chem., 4, 232-237.

101. Kim S.J., Shoda M. (1999) Prečišćavanje i karakterizacija nove peroksidaze iz Geotrichum candidum dec 1 uključene u dekolorizaciju boja. Appl. Environ. Microbiol., 65,1029-1035.

103. Peterhans, A.; Mecklenburg, M.; Meussdoerffer, F.; Mosbach, K. (1987) Jednostavan kompetitivni enzimski imunosorbentni test koji koristi fuzije antigen-beta-galaktozidaze. Anal. Biochem., 163, 470-475.

103. Ann. N. Y. Acad. Sci., 646, 125-135.

104. Lindbladh, C.; Persson, M.; Bulow, L.; Stahl, S.; Mosbach, K. (1987) Dizajn jednostavnog kompetitivnog ELIS A koristeći konjugate humane proinsulin-alkalne fosfataze pripremljene fuzijom gena. Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 607-614.

105. Gillet, D.; Ezan, E.; Ducancel, F., Gaillard, C.; Ardouin, T.; Eastin, M.; Menez, A.; Boulain, J.-C.; Grogent, J.-M. (1993) Enzimski imunoesej koristeći rekombinantni tragač prolaktin-alkalne fosfataze štakora. Anal. Chem., 65, 1779-1784.

106. Lewis, J. C.; Daunert, S. (1999) Dvostruka detekcija peptida u testu fluorescentnog vezivanja upotrebom genetski spojenih GFP i BFP mutanata. Anal. Chem., 71,4321-4327.

107. Lindbladh, S.; Mosbach, K.; Bulow, L. (1991) Priprema genetski spojenog konjugata protein A/luciferaze za upotrebu u bioluminiscentnim imunotestovima. J. Immunol. Metode, 137, 199-207.

108. Gillet, D.; Ducancel, F.; Pradel, E.; Leonetti, M.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1992) Umetanje neurotoksina koji sadrži disulfide u alkalnu fosfatazu E. coli: hibrid zadržava obje biološke aktivnosti. Protein Eng., 5, 273278.

109. Chanussot, C.; Bellanger, L.; Ligny-Lemaire, C.; Seguin, P.; Menez, A.; Boulain, J. C. (1996) Inženjering rekombinantnog kolorimetrijskog fuzionog proteina za imunodijagnostiku insulina. J. Immunol. Metode, 197, 39-49.

110. Kerschbaumer, R. J.; Hirschl, S.; Schwager, C.; Ibl, M.; Himmler, G. (1996) pDAP2: vektor za izgradnju fuzionih proteina alkalne fosfataze. Imunotehnologija, 2, 145-150.

111. Karlsson, R.; Michaelsson, A.; Mattsson, L. (1991) Kinetička analiza interakcija monoklonskih antitela i antigena sa novim analitičkim sistemom zasnovanim na biosenzoru. J. Immunol. Metode, 145, 229-240.

112. A.M. Egorov, E.M. Gavrilova i I.Yu. Sakharov (2000) Primjena peroksidaza u modernoj biotehnologiji, U integriranim biljnim sistemima, H. Greppin et al., ur. Univerzitet u Ženevi, str. 1-18

113. Krueger, J.K., Stock, A.M., Schutt, C.E., Stock, J.B. 1990. Inkluzijska tijela iz proteina proizvedenih u visokim razinama u E. coli, pp. 136-142. L.M. Gierasch i J. King (ur.), Protein folding, American Association for Advances in Science, Washington.

114. Marston, F.A.O. 1986. Prečišćavanje eukariotskih polipeptida sintetiziranih u E. coli. Biochem. J. 240: 1-12.

115. Mitraki, A., King, J. 1989. Intermedijeri savijanja proteina i formiranje inkluzijskih tijela. Bio/Technol. 7: 690-697.

116. Schein, C.H. 1989. Proizvodnja rastvorljivih rekombinantnih proteina u bakterijama. Bio/Technol. 7: 1141-1147.

117. Taylor, G., Hoare, M., Grey, D.R., Marston, F.A.O. 1986. Veličina i gustina inkluzijskih tijela proteina. Bio/Technol. 4: 553-557.

118. Anfmsen, C.B. 1973. Principi koji upravljaju savijanjem proteinskih lanaca. Science 181:223-230.

119. Achareya, A.S., Taniuchi, H. 1982. Implikacija strukture i stabilnosti disulfidnih intermedijera lizozima na mehanizam renaturacije. Mol. Cell. Biochem. 44: 129-148.

120. Greaton, T.E. 1986. Disulfidne veze kao probe puteva savijanja proteina, pp. 83-106. U: C.W.H. Hirs (ur.), Methods in Enzymology, vol. 131. Academic Press, New York.

121. Greaton, T.E. 1990. Protein folding. Biochem. J. 270: 1-16.

122. Freedman, R.B., Hillson, D.A. 1980. Formiranje disulfidnih veza, pp. 157-212. U: R.B. Freedman i H.C. Hawkins (ur.), Enzimologija post-translacijske modifikacije proteina, vol. 1. Academic Press, London.

123. Gierasch, L.M., King, J. 1990. Protein folding. Američko udruženje za napredak u nauci, Washington.

124. Harrison, S.C., Durbin, R. 1985. Postoji li jedan put za savijanje polipeptidnog lanca? Proc. Natl. Akad. Sci. USA 82: 4028-4030.

125. Jaenicke, R. 1988. Postoji li kod za savijanje proteina?, str. 16-36. U: R. Huber i E.L. Winnaker (ur.), Proteinska struktura i proteinsko inženjerstvo, vol. 39. Springer-Verlag, Berlin.

126. Jaenicke, R. 1991. Savijanje proteina: lokalna struktura, domeni i sklopovi, pp. 387-396. U: I. Jornvall i G. Gustavsson (ur.), Metode analize sekvenci ionskih proteina. Birkhauser Verlag, Basel.

127. Jaenicke, R. 1991. Savijanje proteina: lokalna struktura, domeni, podjedinice i sklopovi. Biochemistry 30: 3147–3161.

128. King, J. 1986. Genetička analiza puteva savijanja proteina. Bio/Technol. 4: 297-303.

130. Kim, P.S., Baldwin, R.L. 1982. Specifični intermedijari u reakciji savijanja malih proteina i mehanizam savijanja proteina. Ann. Rev. Biochem. 51: 459-489.144145146147148149150,151.152.153.154.155.156.157.

131. Ahmed, A.K., Schaffer, S.W., Wetlaufer, D.B. 1975. Neenzimska reaktivacija reducirane goveđe pankreasne ribonukleaze oksidacijom zraka i puferima za oksidoredukciju glutationa. J Biol. Chem. 250:8477-8482.

132. Saxena, V.P., Wetlaufer, D.B. 1970. Formiranje trodimenzionalne strukture u proteinima. Biochemistry 9:5015-5022.

133. Odorzynski, T.W., Light, A. 1979. Ponovno savijanje miješanog disulfida goveđeg tripsinogena i glutationa. J Biol. Chem. 254:4291-4295. Anderson, W.L., Wetlaufer, D.B. 1976. Preklopni put reduciranog lizozima. J Biol. Chem. 251: 3147-3153.

134. Grigorenko V, Andreeva I, Borchers T, Spener F, Egorov A. Genetski modifikovani fuzioni protein sa peroksidazom hrena kao markerski enzim za upotrebu u kompetitivnim imunotestovima. Anal Chem. 2001. 15. mart; 73(6), 1134-9.

Napominjemo da su gore navedeni naučni tekstovi objavljeni samo u informativne svrhe i da su dobijeni putem prepoznavanja originalnog teksta disertacije (OCR). S tim u vezi, mogu sadržavati greške povezane s nesavršenim algoritmima za prepoznavanje. Nema takvih grešaka u PDF datotekama disertacija i sažetaka koje dostavljamo.

Pronalazak se odnosi na biotehnologiju. Metoda za proizvodnju peroksidaze hrena uključuje homogenizaciju korijena rena, ekstrakciju enzima, koncentriranje ultrafiltracijom i taloženje proteina amonijum sulfatom. Proteinski precipitat se dijalizira protiv vode i 0,01-0,03 M otopine TEA-HCl pufera, nakon čega slijedi pročišćavanje peroksidaze iz balastnih proteina na koloni sa DEAE-celulozom u istom puferu. Zatim se prečišćavanje nastavlja u 0,01-0,03 M otopini MOPS-NaOH pufera na koloni sa CM-celulozom pri pH i pK vrijednosti pufera 7,1-7,4 odnosno 7,5-7,6. Prečišćeni ciljni proizvod se dijalizira protiv vode i 0,01-0,03 M NaCl i zatim liofilizira. Metoda pojednostavljuje proizvodnju visoko prečišćene peroksidaze hrena i povećava njen prinos. 2 plate f-ly.

Pronalazak se odnosi na biohemiju i biotehnologiju, odnosno na proizvodnju visoko prečišćene peroksidaze hrena adsorpcionom hromatografijom.

Visoko pročišćena peroksidaza hrena (kriterijum prečišćavanja A 403 / A 275 3.1 - RZ od Reinheitszahl - pokazatelj čistoće) je jedan od najpopularnijih enzima za biohemiju i biotehnologiju. Posebno se široko koristi u metodama enzimskih imunoanaliza, na primjer, za određivanje HIV infekcije, hepatitisa i drugih društveno značajnih ljudskih bolesti.

Poznata je metoda za proizvodnju peroksidaze, koja uključuje homogenizaciju korijena hrena, ekstrakciju enzima vodom ili fiziološkim rastvorom, frakcioniranje ekstrakta amonijum sulfatom, prečišćavanje gel filtracijom, taloženje alkohola, reprecipitaciju amonijum hloridom, filtraciju kroz Sephadex G- 50, jonoizmenjivačka hromatografija i dijaliza.

Nedostaci ove metode su složenost i trajanje proizvodnje, relativno niska čistoća dobivenog lijeka (RZ ~ 2,7) i teškoća dobivanja velike količine enzima.

Poznata je i metoda za proizvodnju peroksidaze, uključujući homogenizaciju korijena rena, ekstrakciju enzima, frakcioniranje ekstrakta amonijum sulfatom i gel filtraciju.

Nedostatak ove metode je nizak prinos enzima i njegova niska čistoća.

Cilj ovog pronalaska je povećanje prinosa visoko prečišćenog enzima uz pojednostavljenje metode proizvodnje.

Problem je riješen činjenicom da je predložena metoda za dobivanje peroksidaze hrena koja uključuje homogenizaciju korijena hrena, ekstrakciju enzima, koncentriranje ultrafiltracijom, taloženje proteina amonijum sulfatom, dijalizu proteinskog sedimenta na 0,01-0,03 M otopinu TEA (trietanolamin)-HCl pufer, sekvencijalno prečišćavanje peroksidaze iz balastnih proteina na koloni sa DEAE-celulozom u istom puferu, a zatim u 0,01-0,03 M rastvoru MOPS (N-morfolinopropansulfonske kiseline)-NaOH pufera na koloni sa CM-celuloza, pri pH i pK vrijednostima puferi bliski izotopu ciljnog produkta, i koncentracija koja osigurava kretanje peroksidaze niz kolonu, po principu adsorpcije-desorpcije, brzinom manjom od one neke od balastni proteini koji imaju isti naboj kao naboj na koloni, dok drugi dio ostaje u startu zbog jonske izmjene; rastvor pročišćenog ciljnog produkta se dijalizira protiv vode i 0,01-0,03 M NaCl, nakon čega slijedi liofilizacija, pri čemu se enzim ekstrahuje vodom nakon homogenizacije korijena, dodaje se amonijum sulfat u koncentraciji 70-75% zasićenja, a pH i pK vrijednosti pufera su 7, 1-7,4 i 7,5-7,6 respektivno.

Razlika između ove metode je istovremena upotreba istog nosača za adsorpcijsku hromatografiju ciljnog proizvoda i za pročišćavanje od balastnih proteina, pri pH vrijednostima bliskim izotopu ciljnog proizvoda, kao i korištenje pufera niske koncentracije. sa pK vrijednostima bliskim izotopu enzima, a komponente pufera imaju glomazne grupe koje doniraju ili povlače elektrone koje se nadmeću za adsorbent sa grupama makromolekule peroksidaze. Peroksidaza rena se dobija iz soka korena hrena, sakupljenog na samom početku cvetanja, pri čemu je sadržaj enzima u korenu 3-4 puta veći u odnosu na prototip.

Tehnički rezultat rješavanja problema je proizvodnja peroksidaze sa RZ 3,35 i aktivnost od 1000 jedinica/mg enzima (supstrat 4-aminoantipirin) u jednoj fazi. Prinos enzima je 3,2 g sa 100 kg korijena, što je 6 puta više u odnosu na prototip. Predložena metoda omogućava smanjenje broja faza i time smanjenje vremena za dobivanje ciljnog proizvoda i povećanje njegovog prinosa za 1,5-2 puta.

Poznato je da je adsorpcija proteina na bilo kojem sorbentu povezana s različitim nekovalentnim interakcijama makromolekularnih grupa s površinom ovog sorbenta. Međutim, njihova ukupna energija je mala u poređenju sa, na primjer, vezivanjem proteina-inhibitora u afinitetnoj hromatografiji ili ionskim interakcijama na ionskom izmjenjivaču. Dakle, interakcija adsorpcije je maskirana drugim, jačim interakcijama između površine proteina i površine potpore. Stoga, ako se namjerava pročistiti dati protein adsorpcionom hromatografijom, potrebno je stvoriti uslove da se balastni proteini ili vežu za kolonu ili kreću duž nje brže od ciljnog proteina, tj. tako da se samo ovaj protein može polako kretati po principu adsorpcije-desorpcije. Takvi uslovi se stvaraju ako se celuloza koristi kao nosač za adsorpcionu hromatografiju, a DEAE i CM grupe se koriste za prečišćavanje od balastnih proteina. Da bi se postiglo istovremeno kretanje ciljnog enzima po principu adsorpcione hromatografije, i dijela balastnih proteina - zbog odbijanja nabijenog proteina od slično nabijenih grupa, potrebno je kombinovati ove grupe i celulozni nosač, tj. koristite DEAE i CM celulozu. Ako se hromatografija provodi pri pH vrijednostima bliskim izotopu ciljnog enzima, neki od balastnih proteina kasne u startu zbog ionske izmjene, a neki se brzo spuštaju naniže zbog interakcije s istim nabojima ionskog izmjenjivača . Nenabijeni ili slabo nabijeni enzim će se kretati polako, u poređenju sa balastnim proteinima, prema dolje na DEAE i CM celulozi u slučaju konkurencije između enzimskih grupa i puferskih komponenti za sorbent.

Tampon ima:

1) mala koncentracija, jer kada se ona poveća, konkurencija između komponenti pufera može biti toliko jaka da će se ciljni proizvod kretati brzinom koja je uporediva sa brzinom kretanja balastnih proteina, a prečišćavanje neće doći;

2) pošto pufer mora da obezbedi stabilnu pH vrednost pri niskoj koncentraciji, mora imati pK blizu izotopa ciljnog proizvoda;

3) komponente pufera moraju imati glomazne grupe da bi se efikasno nadmetale sa površinskim grupama ciljnog proizvoda. Balastni proteini će biti napunjeni pri ovoj pH vrijednosti i, ovisno o naboju, ili će ostati na početku (“jonska izmjena”) ili će se kretati mnogo brže od ciljnog proizvoda (interakcija sličnih naboja). Nenabijeni ili slabo nabijeni ciljni proizvod bit će odvojen i od proteina koji su ostali na početku i od proteina koji se brzo kreću. Samo proteini sa izotočkama blizu izotočke peroksidaze mogu se vezati adsorpcijom i time smanjiti stepen prečišćavanja, ali, kako iskustvo pokazuje, takvi proteini su odsutni ili su u manjim količinama u soku od korena rena.

Ciljno prečišćavanje proizvoda:

1) proteini iz soka korena rena se nakon homogenizacije ekstrahuju vodom, ultrafiltracijom dovode do početne zapremine soka, talože se amonijum sulfatom, dijaliziraju u vodi, a zatim u 0,01-0,03 M TEA-HCl puferu, pH 7,1-7, 4 i nanesene uzastopno na kolone sa DEAE-celulozom u Cl - obliku i KM-celulozom u Na + obliku, izbalansirane, respektivno, sa 0,01-0,03 M TEA-HCl i 0,01-0,03 M MOPS- NaOH puferima, pH 7,1-7,4 ( pK puferi 7,5 i 7,6 izotop peroksidaze 7,2);

2) vizuelno se prati sporo kretanje braon enzimskog prstena;

3) nakon što enzim napusti kolonu sa CM-celulozom, dijalizira se uzastopno protiv vode i 0,01-0,03 M NaCl, razblaži do 2-5 mg/ml rastvorom 0,01-0,03 M NaCl i liofilizira;

4) izmjerite RZ vrijednosti proizvoda i njegovu aktivnost za 4-aminoantipirin.

Za mjerenje aktivnosti peroksidaze u kivetu dodajte 1,5 ml otopine fenol-aminoantipirina (810 mg fenola je rastvoreno u 40 ml vode, dodajte 25 mg 4-aminoantipirina i razblažite vodom do 50 ml), 1,4 ml vodikovog peroksida rastvora (1 ml 30 % H 2 O 2 se razblaži vodom do 100 ml; zatim se 1 ml ovog rastvora razblaži sa 0,2 M kalijum fosfatnog pufera, pH 7,0 do 50 ml), 0,1 ml rastvora enzima. Mjerenja optičke gustoće se vrše na 510 nm i temperaturi od 25°C. Odredite brzinu iz linearnog dijela krivulje:

jedinica/mg=(A 510/min)/6,58×mg enzima/ml.

Koncentracija enzima je jednaka: mg enzima/ml = A 403 × 0,44.

Sljedeći primjeri ilustruju ove tačke.

Primer 1. 100 kg dvogodišnjeg korena hrena, sakupljenog na početku cvetanja, opere se vodom, homogenizuje, enzim ekstrahuje vodom, koncentriše ultrafiltracijom do početne zapremine soka, a protein se istaloži. sa amonijum sulfatom (70% zasićenja). Talog se otopi u minimalnoj količini vode i dijalizira protiv nje, a zatim protiv 0,01 M TEA-HCl pufera, pH 7,1. Koncentracija proteina je podešena na 80 mg/ml koncentracijom ultrafiltracijom (određivanje proteina prema Bradfordu ili Lowryju) i nanesena na kolonu (10x20 cm) sa DEAE-celulozom, uravnoteženom sa 0,01 M TEA-HCl puferom, pH 7,1 i pK 7 ,5. Nakon gravitacionog protoka kroz smeđi prsten, nanosi se na kolonu iste zapremine sa CM-celulozom, ekvilibrisanu sa 0,01 M MOPS-NaOH puferom, pH 7,1 i pK 7,5. Nakon što enzim napusti kolonu sa CM-celulozom, dijalizira se uzastopno protiv vode i 0,01 M NaCl, razrijedi do 2-5 mg/ml sa rastvorom 0,01 M NaCl i liofilizira.

Primer 2. 100 kg dvogodišnjeg korena hrena, sakupljenog na početku cvetanja, opere se vodom, homogenizuje, enzim ekstrahuje vodom, koncentriše ultrafiltracijom do početne zapremine soka, a protein se istaloži. sa amonijum sulfatom (75% zasićenja). Talog se otopi u minimalnoj količini vode i dijalizira protiv nje, a zatim protiv 0,03 M TEA-HCl pufera, pH 7,4. Koncentracija proteina je podešena na 80 mg/ml koncentracijom ultrafiltracijom i nanesena na kolonu (10x20 cm) sa DEAE-celulozom, uravnoteženu sa 0,03 M TEA-HCl puferom, pH 7,4, pK 7,6. Zatim se ciljni proizvod hromatografira, kao u primjeru 1, na CM celulozi, ali u 0,03 M MOPS-NaOH puferu, pH 7,4, pK 7,6. Nakon što enzim napusti kolonu sa CM-celulozom, dijalizira se uzastopno protiv vode i 0,03 M NaCl, razrijedi do 2-5 mg/ml sa rastvorom 0,03 M NaCl i liofilizira.

Prinos: 3,2 g peroksidaze sa RZ 3,35 i aktivnošću od 1000 jedinica/mg enzima za 4-aminoantipirin.

Primjer 3. 15 g liofiliziranog praha peroksidaze sa RZ 0,3 suspendira se u 0,01 M TEA-HCl puferu, pH 7,1, centrifugira (20 min, 3000 g) i 300 ml supernatanta se nanese na kolonu (10x20 cm) sa DEAE -celuloza ekvilibrirana sa istim puferom. Nakon prolaska kroz braon prsten gravitacijom, nanosi se na kolonu iste zapremine sa CM-celulozom, ekvilibrisanu sa 0,01 M MOPS-NaOH puferom, pH 7,1, pK 7,5. Nakon što enzim napusti kolonu sa CM-celulozom, dijalizira se uzastopno protiv vode i 0,01 M NaCl, razrijedi do 2-5 mg/ml sa rastvorom 0,01 M NaCl i liofilizira.

Primjer 4. 15 g liofiliziranog praha peroksidaze sa RZ 0,3 suspendira se u 0,03 M TEA-HCl puferu, pH 7,4, centrifugira (20 min, 3000 g) i 300 ml supernatanta se nanese na kolonu (10x20 cm) sa DEAE- celuloza, ekvilibrirana sa istim puferom. Nakon prolaska kroz braon prsten gravitacijom, nanosi se na kolonu iste zapremine sa CM-celulozom, ekvilibrisanu sa 0,03 M MOPS-NaOH puferom, pH 7,4, pK 7,6. Nakon što enzim napusti kolonu sa CM-celulozom, dijalizira se uzastopno protiv vode i 0,03 M NaCl, razrijedi do 2-5 mg/ml sa rastvorom 0,03 M NaCl i liofilizira.

Prinos je 1,5 g ciljnog proizvoda sa RZ od 3,35 i enzimskom aktivnošću od 1000 jedinica/mg za 4-aminoantipirin.

Dakle, predložena metoda, u poređenju sa prototipom, omogućava da se dobije ciljni proizvod sa RZ 3,35 i enzimskom aktivnošću od 1000 jedinica/mg za 4-aminoantipirin. Prinos enzima je 3,2 g na 100 kg korijena, što je približno 6 puta više od prinosa prema prototipu. Pored toga, dobijeni ciljni proizvod ima veću čistoću u odnosu na prototip (RZ 3,35 i 2,7, respektivno). Pojednostavljenje metode se izražava u smanjenju biohemijskih stadijuma sa četiri na jedan. Ova metoda također omogućava izolaciju visoko pročišćene peroksidaze iz liofiliziranog enzima niske čistoće.

Literaturni izvori

1. Paul K.G. Enzimi. New York, Acad. Štampa, 1963.

2. RF Patent br. 2130070.

FORMULA PRONALASKA

1. Metoda za proizvodnju peroksidaze hrena, koja uključuje homogenizaciju korijena hrena, ekstrakciju enzima, koncentriranje ultrafiltracijom, taloženje proteina amonijum sulfatom, dijalizu sedimenta, naznačen time što se proteinski sediment dijalizira prema vodi i 0,01-0,03 M rastvor TEA-HCl pufera sa naknadnim prečišćavanjem peroksidaze iz balastnih proteina na koloni sa DEAE-celulozom u istom puferu, a zatim u 0,01-0,03 M rastvoru MOPS-NaOH pufera na koloni sa CM-celulozom, pri pH i pK vrijednosti pufera blizu izotočke ciljnog proizvoda su 7,1-7,4 i 7,5-7,6, respektivno, pročišćeni ciljni proizvod se dijalizira protiv vode i 0,01-0,03 M NaCl, a zatim liofilizira.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što se enzim ekstrahuje vodom nakon homogenizacije korijena.

3. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, što se amonijum sulfat dodaje u koncentraciji od 70-75% zasićenja.

"Postoji niz lokalizacija raka koje se praktično ne mogu liječiti. Na primjer, kada
metastaze prodiru u jetru, a u takvim slučajevima ni kemoterapija ne pomaže. I samo u rijetkim slučajevima metastaze se mogu ukloniti kirurški. Ali znali smo da peroksidaza hrena povećava imunitet organizma, a to je glavni uvjet za liječenje. Čak su naučili kako da dobiju ovu istu peroksidazu u njenom čistom obliku. Ali pokazalo se da je to bila luda ideja - 5 grama je izašlo iz tone sirovina! Jednom sam pročitao u trotomnoj knjizi „Imunologija“, objavljenoj u SSSR-u 1974. godine, da unošenje peroksidaze iz hrena u krv povećava efikasnost liječenja za 4 hiljade puta! Ali tek mnogo godina kasnije shvatio sam kako da ga dam - kroz klistir!
Evo kako se to radi
Hren naribajte na najsitnije rende. Uzmite 1 tbsp. kašiku rena i prelijte sa pola čaše proključale vode. Ostavite u frižideru 12 sati. Uzmite dječji klistir i dajte 30-40 grama nakon stolice. Ali prvo uradite klistir za čišćenje.
Tako se tinktura trenutno apsorbira i odmah ulazi u jetru. Na površini leukocita kod pacijenata oboljelih od raka nalaze se receptori koji percipiraju peroksidazu hrena, a zatim se aktivacija leukocita ubojica povećava četiri hiljade puta.
Nakon 10-15 procedura, metastaze raka nisu otkrivene niti su zaustavljene na kontrolnom snimku. Svaki drugi dan uradite klistir s hrenom.
Teže je liječiti rak pluća peroksidazom iz hrena. Najbolji način je inhalacija, ali će biti efikasna ako se ren zgnječi na 3-5 mikrona, ništa veće ne apsorbira.
Institut za bioinstrumentotehniku ​​razvio je specijalne spinhill inhalatore koji mogu samljeti hren i pripremiti stotinu inhalacija. Razvijeno, ali ne i pušteno, jer u ovom slučaju postaje hren lijek! A to znači sedam godina testiranja, godine odobrenja itd.
Ali farmaceutska komisija ne zabranjuje disanje, trljanje i disanje, već u samom procesu trljanja dovoljno ćete disati, a zatim, pokriveni ručnikom, disati preko proizvedenog lijeka. Postupak će trajati 2-3 minute. A možda ću sačekati spinhilere - imam samo 72 godine!

Dakle, protrljate korijen rena i dišite 1-2 minute dok vam suze ne poteku iz očiju. Ovo treba raditi svakodnevno do potpunog oporavka.
Jednog dana u našu redakciju javio se čitatelj koji je bolovao od hronične upale pluća. Ona ima 58 godina i tako je izliječena za manje od mjesec dana.

"- Leonid Nikolajevič Ž. iz Nemačke, ima metastaze u jetri. I ovaj organ se praktično ne leči, međutim, eksperimenti sa mikroklistirima od hrena pokazali su pozitivni rezultati. Leonid Nikolajevič je pokušao, ali je osetio jako peckanje i nije mogao da zadrži tečnost dovoljno dugo. Koji savjet mu možete dati?
- Očigledno, osoba se previše koncentrisala. S obzirom na to da klistir ne smije prelaziti 30 grama, ne treba ga držati, a sama tečnost će tu ostati. Prije zahvata, ako niste imali stolicu, potrebno je napraviti klistir za čišćenje. Ukupno bi trebalo da obavite 10-15 sesija svaki drugi dan, a po završetku posetite lekara...

Evo poziva iz Njemačke, iz grada Essena. Leonid Žuravski (već sam ga spomenuo kada smo pisali o klistirima sa infuzijom rena, imao je nekih problema sa njihovom upotrebom) ima tešku bolest, njegova jetra je već zahvaćena metastazama. Jasno je da u takvim slučajevima govorite s krajnjim oprezom, jer možete očekivati ​​bilo šta. I odjednom čujem: „Rast metastaza je stao, ako razgovarate ili vidite doktora Laskina, recite mu moju iskrenu zahvalnost. I hvala vam na vašim publikacijama."

X
....„Vratila sam se sa odmora i saznala da je Nina odbijena. Pronašao sam časopise FiS sa člancima dr. Laskina i počeli smo koristiti njegove metode liječenja tinkturama hrena i heljde. Problem je bio u tome što Nina već gotovo ništa nije jela, a nije mogla ni piti. Patila je od stalne mučnine i povraćanja, čak i nakon što je pila vodu. Prvi klistir od hrena izazvao je peckanje, a sljedeći su bili bezbolni, već je urađeno ukupno 10 zahvata. Nina je počela malo po malo jesti i heljdinu kašu uz dodatak male količine maslinovo ulje. Jučer je popila dva sirova jaja. Tijelo je normalno prihvatilo prvo jaje (bilo je za ručkom), a Nina je rekla: “Tako sam se dobro osjećala!”...
Molim vas za pomoć. Želimo da dobijemo konsultacije od dr. Laskina i drugih specijalista, i to što pre, pošto se meseci ne računaju, svaki dan je skup.
Može li se klistir s hrenom raditi više od 15 puta?
....Kontaktirali smo koautora dijete Aleksandra Baljuru. Uzgred, on je sada naporan na poslu što ga čini lakšim za korištenje lekovita svojstva Hren, odnosno peroksidaza koju sadrži, aktivira makrofage koji uništavaju ćelije raka. Dakle, Baljura eksperimentiše sa zatvaranjem hrena u zatvorenu epruvetu, gde će se, da tako kažemo, sačuvati i tečnost i duh. Uostalom, u megagradovima kao što je Moskva, na primjer, problem je pronaći korijen hrena ako nema parcele van grada, a čak i da postoji, tamo rijetko raste, a gradske vlasti su odavno eliminirale bakice koje su prodavale u blizini metro.
Evo šta kaže A. Baljura: „U tako teškoj situaciji kao kod prijatelja autora pisma, možete dalje da radite klistire od tinkture hrena. Možete smanjiti količinu tekućine na 5 ml (ovo je samo žlica otopine). Uz pravilnu pripremu: sitno izrendati, razblažiti hladnom prokuhanom vodom, ostaviti u frižideru 10-12 sati.”
X

Ali žena iz regiona Donjecka zabrinuta je za svog oca. Žive u različitim gradovima Ukrajine, a ćerka daje savete ocu i njegovoj porodici, očigledno preko telefona. Očev želudac i jetra su zahvaćeni, ali nakon jela heljde i mikroklistira od natopljenog hrena, jetra se smanjila na normalna veličina. Ali ispostavilo se da se proces preselio i na pluća, pa sada redovno udiše isparenja rendanog rena.
X

Nekoliko pitanja „tehnološke prirode“. Čitalac M. iz Tule pita zašto se hren za davanje kroz klistir mora uliti i držati u frižideru 12 sati? Postoji li minimum i maksimum? Objašnjavamo: 10-12 sati - ovo vrijeme je dokazano u laboratoriji. Potrebno je samo narendati 1 kašiku. kašiku rena, ali ga nemojte koristiti za buduću upotrebu, svaki put mora biti sveže napravljen.
Jedan čitatelj se žali da nakon 12 sati tinktura postaje prehladna i pita da li se može razrijediti toplom vodom? Odgovaramo: nemoguće je, kakva će to biti koncentracija? Samo držite tinkturu na sobnoj temperaturi neko vrijeme nakon hlađenja i ona će postati prihvatljiva za upotrebu.
Više o hrenu. Do sada je poznato da dobro deluje na jetru, čak i kada je zahvaćena metastazama. U drugim slučajevima, Laskin ne preporučuje korištenje klistira.
Ali možete i trebate disati natrljani hren ako imate bolest ne samo pluća, već i bronhija, grla, nosa, odnosno cijelog područja nazofarinksa. Da biste to učinili, dovoljno je provesti postupak dva puta dnevno po 2-3 minute dok suze ne poteku iz očiju. Da vas podsjetim da na ovaj način možete otkloniti lakša oboljenja – gripu, prehladu, curenje iz nosa.”

Kao odgovor na prvo pismo mogu reći sljedeće. Klistire od hrena su, kako je praksa pokazala, najviše efikasan način prodiranje ljekovitih supstanci u jetru kako bi se izborili s metastazama. Klistir treba raditi na sljedeći način: 1 tbsp. kašičicu rendanog rena preliti sa 0,5 šolje ohlađene prokuvane vode, i sve staviti u frižider (ali ne u zamrzivač) na 8-12 sati. Zatim procijedite infuziju i oko 20 ml uzmite u klistir (mali, za djecu) za primjenu u tijelo. Kašu od hrena nikako ne treba ubrizgavati u rektum, jer je previše koncentrirana i može dovesti do opekotina sluzokože.
Ostatak procijeđene infuzije može se čuvati još jedan dan u frižideru da bi se od toga sutradan napravio još jedan klistir. Takve klistire treba davati nakon pražnjenja crijeva. Klistir možete raditi svakodnevno, ali svaki drugi dan pripremite novu infuziju hrena kako biste u potpunosti iskoristili njegova svojstva protiv raka.
Nadam se da će moji odgovori pomoći piscima pisama da se nose sa bolešću. Veoma smo zabrinuti zbog rezultata tretmana. U svakom slučaju, pišite o njima uredniku.
Uz najbolje želje za oporavak,
Aleksandar BALYURA, kandidat medicinskih nauka

Kuhajte 1 kg cvekle na 5 litara vode 5-6 sati na laganoj vatri, dobićete gusti odvar, rastvara kamenje, isprobao sam metodu na sebi, sretno.

U broju 8 AiF-Health-a za 2008. pročitao sam da, prema Kanadskom udruženju liječnika i Međunarodnoj agenciji za istraživanje raka, mnogi biljni proizvodi sadrže moćne supstance protiv raka. To su kupus (karfiol, brokula, prokulice), beli luk, crni luk (luk i ljutika), spanać, potočarka, laneno seme, laneno ulje, paradajz, crni biber, kurkuma, borovnice, maline, kupine, borovnice, brusnice, grožđe, crna čokolada, agrumi, zeleni čaj, crno vino). Svakodnevno uzimanje ovih namirnica može zaštititi od raka, čak i ako imate lošu porodičnu anamnezu. S tim u vezi, imam dva pitanja. Ako je to tako jednostavno, zašto ljudi u svim zemljama ne jedu ovu hranu svaki dan kako bi se zaštitili od raka? Zašto kaša od heljde i maslinovo ulje, koji čine osnovu antikancerogene dijete dr. Laskina, nisu uvršteni na ovu listu?
Marina L., Moskva
Ne samo heljda
Prehrambena metoda prevencije i terapije raka ubrzano se razvija posljednjih godina. Brojni stručnjaci koji rade u ovoj oblasti čak smatraju rak „bolešću deficita“, odnosno bolešću koja nastaje zbog nedovoljne konzumacije posebnih fitokemikalija koje se nalaze u zelenom čaju, crvenom vinu, smeđem pirinču, bobicama, voću, povrću, gljivama, orašastim plodovima. , sjemenke, začini. Ljudski organizam se hiljadama godina prilagođavao ovakvoj ishrani, a prelazak u 20. veku na ishranu rafinisanih ugljenih hidrata (beli hleb, beli šećer, slatkiši, konditorski proizvodi) je tragično uticao na njegovo zdravlje. Rak je postao jedna od glavnih bolesti civilizacije. Povratak na ishranu zasnovanu na prirodnim proizvodima omogućava ljudskom telu da se efikasno odupre raku.
Nedavno razvijeno cela serija dijeta protiv raka. U zapadnim zemljama, kada su u pitanju proizvodi, posebna pažnja se poklanja brusnicama, a kada je u pitanju dijeta, mediteranskoj prehrani (povrće, voće, proizvodi od cjelovitih žitarica, morska riba, maslinovo ulje, suho crno vino).
Tako je nedavno u Sjedinjenim Američkim Državama provedena studija o učinku mediteranske prehrane na sposobnost inhibicije razvoja raka kod 23 pacijenta starosti 43-74 godine koji su odbili radikalno liječenje s biopsijom dokazanim ograničenim karcinomom prostate. Nakon prosječnog praćenja od 38,5 mjeseci, 87% muškaraca je prijavilo 58% smanjenje nivoa PSA (prostatnog specifičnog antigena), markera aktivnosti raka. I 3 muškarca koja su učestvovala u ovoj studiji pokazala su vrlo mala povećanja PSA. Ovi rezultati ukazuju na značajnu efikasnost mediteranske prehrane u smanjenju progresije raka prostate.
Dakle, kombinacija niza prirodnih proizvoda u ishrani omogućava tijelu da kontrolira, spriječi, pa čak i zaustavi proces raka. Zašto ljudi ne jedu redovno ove neverovatne stvari? zdravi proizvodi, ali više volite nezdrave slatkiše, peciva itd.? Da, jer su mnogo ukusniji i, kao i alkohol, izazivaju ovisnost. Ovo je prava ovisnost o hrani, i to je slično ovisnosti o drogama. Kada se rak ipak pojavi, a razne ukusne namirnice trenutno će vam poboljšati raspoloženje, ublažiti stres i depresiju i vratiti duševni mir. Probajte, odustanite! Dok grom ne udari, čovjek se neće prekrstiti. Ovako živimo, tako se razbolijevamo i tako umiremo mnogo ranije od termina.
Sada u vezi sa drugim pitanjem: zašto kaša od heljde i maslinovo ulje nisu uvršteni na listu proizvoda protiv raka? Činjenica je da se kaša od heljde široko konzumira uglavnom u Rusiji, Ukrajini i Bjelorusiji. U SAD-u, Kanadi, zapadnoj Europi jedu je uglavnom emigranti, a heljda se tamo ne uzgaja za hranu, već da bi se iz nje izvukli vitamini, minerali i razne tvari slične vitaminima, uključujući kvercetin.
Čitaoci FiS-a znaju da je antikancerogena svojstva heljdine kaše prvi upotrebio naš sunarodnik onkolog V.A. Laskin. To je bilo prije više od 35 godina. Štaviše, heljdina kaša je počela da pokazuje svoje posebno snažno dejstvo u sklopu stroge dijete (kaša od heljde, maslinovo ulje, šipak, voda). Rezultati njegove upotrebe do kojih je došao Laskin nisu ostavljali sumnje u to. Supruga Wulfa Laskina, takođe doktora po struci, prisjetila se: „Vraćajući se kući u večernjim satima nakon prijema na kojem je ranije bio bolestan od raka, a sada se potpuno oporavio (ipak, mnogi su donijeli zaključak iz onkološke ustanove da više nisu imale rak), muž se nije mogao smiriti cijelo veče i sjedio je uz knjige do kasno u noć, pokušavajući shvatiti zašto dijeta od heljde djeluje tako snažno.” Razumevanje je došlo tek 2000. godine, kada su američki naučnici utvrdili da heljda sadrži 8% kvercetina, jedne od najmoćnijih prirodnih supstanci za prevenciju i terapiju raka.
Što se maslinovog ulja tiče, s moje tačke gledišta, dr. Laskin je donekle podcijenio ulogu maslinovog ulja u svojoj ishrani. Kada sam ga pitao zašto je odabrao maslinovo ulje, odgovorio je da ljudi na Mediteranu jedu dosta maslinovog ulja i malo pate od raka. Ova ideja ga je fascinirala, ali kako nije znao koje su komponente maslinovog ulja zaslužne za antikancerogeno djelovanje, on je, po logici sovjetskog liječnika, više razmišljao o heljdinoj kaši s rekordnim sadržajem kvercetina.
U međuvremenu, posljednjih godina u maslinovom ulju otkriveni su jedinstveni antioksidansi fenolne i nefenolne prirode, koji nisu ništa manje važni od kvercetina u prevenciji raka. A sada sam siguran da je efikasnost Laskinove dijete povezana upravo sa kombinacijom heljdine kaše i velike količine maslinovog ulja (6-8 kašika dnevno).
Sada o korisnim biljnim proizvodima protiv raka, čija je lista objavljena u AiF-Health. Gotovo svi su dio "sedmične dijete" dr. Laskina. Odnosno, prvo 5-6 sedmica (ponekad i duže) pacijent slijedi strogu dijetu, a zatim prelazi na sedmičnu ishranu koja pored heljdine kaše, maslinovog ulja i šipka uključuje borovnice, brokulu, šitake. pečurke... Sa liste proizvoda navedenih u "AiF-Zdravlje" u Laskinov jelovnik bih dodala i brusnice, kurkumu i laneno sjeme.
Zinovy ​​BELKIN, kandidat medicinskih nauka